在生命科学、材料科学等领域，分子级别的观察和分析正成为揭示细胞内部秘密、理解物质行为的核心。然而，尽管传统显微镜技术在一定程度上让我们窥见了微观世界，但它们仍然面临着分辨率和化学信息获取的“双重瓶颈”。特别是在分子振动光谱领域，存在信号较弱的问题。如何突破这些限制，一直是科研人员面临的巨大挑战。
近日，浙江大学物理学院光学与量子信息研究所的张德龙研究员课题组与生物医学工程与科学仪器学院Hyeon Jeong Lee研究员合作，开发了结构光照明中红外光热显微技术（Structured Illumination Mid-Infrared Photothermal Microscopy，简称SIMIP）成功突破了传统光学显微成像的衍射极限，同时保持了分子水平的化学特异性。首次将结构光照明与中红外光热成像技术结合，在振动成像中突破了光学衍射极限，为生物医学和材料科学的研究提供了全新工具。相关成果以“Breaking the Diffraction Limit in Molecular Imaging by Structured Illumination Mid-Infrared Photothermal Microscopy”为题，于2025年4月14日发表在《Advanced Photonics》。
振动光谱技术（如红外光谱）因其能直接揭示分子内部化学键的振动信息，成为了获取分子成分和结构的重要手段。它不仅为我们提供了“分子指纹”，还不需要繁琐的标记物。然而，这项技术面临分辨率受限于光学衍射极限和灵敏度受限的问题，这导致其在空间分辨率和成像速度方面都存在瓶颈，限制了它在更广泛领域的应用。
为了突破这些限制，研究人员创新性地提出了结构光照明中红外光热显微镜（SIMIP），这项技术结合了振动光谱和SIM成像，带来了分子成像领域的新突破。SIMIP利用了结构光照明和红外光热效应相结合的优势，通过对样品进行红外激发，实现了对亚衍射极限的空间信息和化学成分的精准捕捉。具体而言，SIM是一种巧妙的成像技术，它通过在样品上施加精确的干涉图案，利用摩尔效应将原本无法探测的高频空间信息“拉低”到可检测的范围，有效扩展了光学传递函数（OTF），从而突破了传统显微镜的衍射极限。利用红外光的振动吸收选择性的激发分子键，进而通过温度调制荧光分子发射的量子产率。相比于折射率对温度的微弱响应，荧光基团的量子产率对温度的响应约1-2%，提高了约两个数量级。
通过宽场检测红外调制的荧光，SIMIP可以同时获取超出衍射极限的空间特征和特定化学键的对比度，从而提取出整个视场的丰富分子信息。SIMIP的创新之处在于其独特地结合了不同物理过程和图像重建能力：（1）利用荧光检测的灵敏度来获取振动信号;（2）通过结构光照明打破衍射极限;（3）采用改进的重建算法推动空间分辨率超越衍射极限。这些能力的协同效应使SIMIP成为生物医学和材料科学中的强大工具。
研究团队设计的系统基于量子级联激光器（QCL），用于激发特定的分子键，产生局域的光热效应，从而降低邻近荧光分子的“亮度”。与此同时，团队使用的SIM系统由488纳米连续波激光器和空间光调制器（SLM）组成，通过将条纹光图案投射到样品上产生摩尔效应，能够将原本无法解析的高频细节转化为可检测的低频信号。团队使用科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机捕捉这些调制后的荧光信号。利用热致荧光量子产率变化作为探测信号，捕获了“热”（红外打开）和“冷”（红外关闭）两组图像。对比分析这两组图像，可以获得具有分子特异性的超分辨图像。
图1. SIMIP显微镜的成像原理与光路图。
通过应用Hessian SIM和稀疏反卷积算法，研究团队实现了大约330 nm的空间分辨率（物镜数值孔径为0.75）。他们确认，通过后续系统的优化，SIMIP的空间分辨率可以最高达到约60 nm，并且成像速度超过每秒24帧。为了验证SIMIP的准确性，团队在200nm聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）荧光微球上进行了测试。通过将QCL在1420–1778 cm-1的范围内进行调谐，SIMIP成功地重建了振动光谱，且与傅里叶变换红外光谱（FTIR）的结果非常接近。
图2. SIMIP显微镜和FTIR获取的PMMA的光谱对比。
在分辨率方面，SIMIP比传统的中红外光热成像提升了1.5倍，半高全宽（FWHM）为335 nm，相较之下传统成像方法为444 nm。此外，SIMIP能够在亚衍射级别的聚集体内区分出具有同一荧光染料标记的两种高聚物材料（聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯）小球，这在传统的荧光显微镜中是无法做到的。通过将SIM与MIP结合，SIMIP实现了超分辨率化学成像并突破了衍射极限。这项技术为材料科学、生物医学研究和化学分析中的观察提供了新的可能性。
图3. 200 nm高聚物微球的SIMIP成像结果。
该论文的第一共同作者为浙江大学物理学院的博士生傅鹏程和陈博，浙江大学物理学院的张德龙研究员、生仪学院的Hyeon Jeong Lee研究员为本论文的共同通讯作者。其他作者包括北京大学陈良怡教授、浙江大学物理学院博士生张永庆。该研究得到了国家重点研发计划（2024YFA1408900）、国家自然科学基金项目（82372011，12074339）、浙江省自然科学基金项目（LZ25H180001）以及中央高校基本科研业务专项资金（2025ZFJH01-01）的支持。
论文链接：https://doi.org/10.1117/1.AP.7.3.036003
